Методы лабораторной диагностики вирусного гепатита В
Расчет
По оптической плотности пробы в калибровочном графике находят концентрацию фермента.
Предупреждение
Пробы сыворотки крови можно хранить при температуре (от +2 до +8)°С в течении одной недели.
При каталитической концентрации фермента свыше 0,56 мккат/л анализ проводят с сывороткой, разбавленной физиологическим раствором (результат умножить на разведение).
|
При кат. концентрации фермента |
Разведение |
|
(0,56 - 0,70) |
3х |
|
(0,70 - 0,80) |
5х |
|
(0,80 - 1,00) |
10х |
|
(1,00 - 1,20) |
30х |
|
Свыше 1,20 |
50х |
Повышенное содержание кетоновых тел (в сыворотках диабетиков) вызывает повышение активности ферментов АсАТ и АлАТ. В таких случаях необходимо вычесть из оптической плотности пробы оптическую плотность сывороточного контрольного раствора. Сывороточный контрольный раствор приготавливают точно так же, как и пробу, с той лишь разницей, что сыворотку добавляют в пробирку после реактива 2.
Гемолиз повышает каталитическую концентрацию ферментов АсАТ и АлАТ. Снижение результатов вызывают синтетические моющие средства (сапонаты).
Референтные величины
АсАТ (мккат/л) 0,06-0,14
Предельные величины 0,42
Метод определения активности аланинаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.) в сыворотке крови динитрофенилгидразиновым методом (по Райтману, Френкелю, 1957)
Принцип метода
Аланинаминотрансфераза (
L
-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза, К.Ф. 2.6.1.2.)
катализирует реакцию между L-аланином и 2-оксоглутаратом, в результате которой они превращаются в L-глутамат и соль пировиноградной кислоты. Определение основано на измерении оптической плотности гидразонов и 2-оксоглутаровой и пировиноградной кислоты в щелочной среде. Гидразон пировиноградной кислоты обладает более высокой оптической плотностью.
Реактивы
1. Эталонный раствор натрий пировинограднокислый 2 ммоль/л;
2. 2,4 - динитрофинилгидразин раствор 1 ммоль/л в НСl 1 моль/л;
3. Натрий гидроокись;
4. Субстрат АлАТ:
фосфатный буфер 0,1 моль/л;
DL-альфа-аланин 0,2 моль/л;
2-оксаглуторат 2 ммоль/л;
. 0,9% р-р NaCl.
Приготовление рабочего раствора
Раствор гидроокиси натрия
В мерной колбе вместимостью 1000 мл растворяют в дистиллированной воде содержимое флакона с Реактивом 3. Раствор устойчив.
Ход определения
|
Ингредиенты (мл) |
Проба |
Контрольный раствор |
|
Субстратный раствор АлАТ |
0,5 |
0,5 |
|
Физиологический раствор |
- |
0,1 |
|
Предварительно инкубируют в течении 3 мин при 37°С | ||
|
Сыворотка крови |
0,1 |
- |
|
Перемешивают, инкубируют точно 60 мин при 37°С | ||
|
2,4 - ДНФГ |
0,5 |
0,5 |
|
Перемешивают и оставляют стоять 20 мин при температуре (от + 15°С до +25°С) | ||
|
0,4н NaOH |
5,0 |
5,0 |