Теоретическая часть

Решение данной системы достаточно громоздко и сложноразрешимо в рамках наших допущений ввиду наличия большого количества промежуточных величин. Однако, анализируя данную систему, можно полагать, что наличие блокатора сопровождается некоторыми изменениями решения (2.17). Снижение концентрации вируса на поверхности клетки будет сопровождаться сдвигом, а, следовательно, и уменьшением пика [VR]m, таким образом, уменьшится концентрация вируса и внутри клетки. Значит, наличие блокатора может спровоцировать остановку, или, вероятнее, торможение процесса эндоцитоза.

3. Материалы и методы

· Материалы

1. Вирус. Вирус гриппа, штамм A/Aichi/2/68, получен из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва, прошедший пять пассажей на лёгких мышей и один-два пассажа на культуре клеток MDCK. Гемагглютинирующая активность материала составляла 256 ед. Очистка и концентрирование вируса с помощью фильтра-концентратора Vivaspin 20 (300кДа) и центрифуги (4500 об/мин., 30 мин., t=4ºC)

2. Растворы для реакций

· Раствор фетуина 0.1%-ный в фосфатном буферном растворе

· Стандартный фосфатный буферный раствор (PBS - Phosphate Buffer Solution) в физиологическом растворе, поддерживающий рН 7,2

· Питательная среда RPMI 1640.

· Субстрат:{9ml. H2O +1ml. NaAc(0,5M) +60 mkl.H2O2+6mkg.OFD}

· Флуоресцентный краситель LysoSensor Blue DND-167

· Измерение параметра эффективности ингибитора (IC50) методом ФОЕ

Метод ингибирования фокусообразующих единиц

В работе для измерения концентрации вирусных частиц использована методика связывания вируса с молекулами фетуина. Суть её заключается в следующем. Оболочечный белок вируса гриппа, гемагглютинин, имеет сродство к определённым клеточным рецепторам, сиаловым кислотам. Молекулы фетуина - это модель клеточного рецептора, к которому вирус также имеет специфичное сродство через взаимодействие с сиаловыми кислотами. Конъюгированный с ферментом фетуин при связывании с вирусными частицами позволяет количественно измерить концентрацию вирусных частиц по величине концентрации продуктов ферментативной реакции. По количеству вирионов на поверхности напрямую определяется концентрация вирусных частиц.

Алгоритм определения параметра IC50 методом фокусообразующих единиц (ФОЕ)

1. Готовится раствор фетуина (1мг/1мл PBS).

2. Добавляется в 96-луночные круглодонные стерильные планшеты по 100 мкл поддерживающей среды (ИГЛА ДМЕМ,100 ед/мл пенецилина,100 мкг/мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин , 10 мкг/мл ДЕАЕ-декстрана (Sigma), 5 мкг/мл трипсина TPCK)

. Готовятся серийные двукратные разведений блокатора фетуин, начиная с разведения 1:20 путем переноса 50 мкл пробы в последующую лунку; из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл после последнего разведения блокатора.

. Добавляется в лунки по 50 мкл вирусной суспензии, содержащей ~500 ФОЕ вируса; инкубируется 30 мин при температуре 35оC.

. Удаляется ростовая среда из лунок планшета с монослоем клеток MDCK; монослой двукратно промывается средой для разведения вируса. Перенос (после окончания инкубации) из планшета с разведениями сывороток по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с монослоем клеток

. Инкубируется при 35 оC в течение 18 часов в CO2 атмосфере.

. Удаляется из планшета содержимое (без промывки), добавляется по 50 мкл охлажденного ацетона (80%) в каждую лунку; на 15 минут при комнатной температуре

. Промываюется планшет фосфатно-буферным раствором (ФБР) 2-3 раза по 200 мкл на лунку

. Готовится разведение 1:2000 моноклональных антител к белку NP вируса гриппа А (CDC, Atlanta, Lot 03-0325L) в ФБР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Твин 20, и по 50 мкл добавляется в каждую лунку. 35оC на 60 минут.

. Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку; удаляются лишние капли.

. Добавляется по 50 мкл на лунку раствора конъюгированных биотином антител кролика к иммуноглобулинам мыши (1/3000 в ФБР); на 30 минут при 35 оC.

. Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку.

. Добавляется 50 мкл на лунку раствора конъюгированного пероксидазой хрена стрептавидина (1/2000 в ФБР); на 30 минут при 35 оC.

. Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку.

. Добавляется в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата (9ml. H2O +1ml. NaAc(0,5M) +60 mkl.H2O2+6mkg.OFD); при комнатной температуре в темноте 30 минут.

. Планшет промывается под краном. В каждую лунку добавляется по 50 мкл дистиллированной воды.