Метод флуоресцентной детекции

Во время снятия зависимости интенсивности флуоресценции от времени, параллельно отслеживалось появление флуоресцирующих меток в клеточной суспензии на инвертированном микроскопе Olympus CK40. Первые исследования, проведенные на планшете 96-white показали, что помимо флуоресценции, спровоцированной активацией лизо-сенсора DND-167, имеется сильная флуоресценция самого пластика планшета, что вносит большие помехи, создавая неравномерный фон (таким образом в микроскопе наблюдались четкие светящиеся границы лунок микропланшета). Дальнейшие эксперименты проводились на черных 96 - луночных планшетах с прозрачным дном, что дало возможность в разы уменьшить фон окружения. При микроскопическом изучении культуры клеток результат активации лизо-сенсора наблюдали в виде большого количества светящихся точек в клеточной суспензии, которые отсутствовали до активации.

Алгоритм определения параметра IC50=Kd методом флуоресцентной детекции

1. Готовятся растворы фетуина (1мг/1мл PBS).

2. Добавляется в 96-луночные круглодонные стерильные планшеты по 100 мкл поддерживающей среды RPMI

. Готовятся серийные двукратные разведения блокатора фетуина, начиная с разведения 1:20 путем переноса 50 мкл пробы в последующую лунку; из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл после последнего разведения блокатора.

. Добавляется в лунки по 50 мкл вирусной суспензии, содержащей ~500 ФОЕ вируса; инкубация 30 мин при температуре 35оC

. Добавляется LysoSensorBlueDND-167 к концентрированной клеточной суспензии в соотношении 1/500. Инкубирование при 35 оC в течение 20 минут.

. Разводится окрашенная DND-167 клеточная суспензия поддерживающей средой RPMI (35 оC) в 10 раз, добавляется в планшет по 50 мкл в лунку к суспензиям вирус-фетуин.

. Проводятся измерения во флуориметре Infinite 200 при 37 оC в течение необходимого времени (время исследуемого в данной работе процесса 20-30 минут)

Полученная зависимость интенсивности флуоресценции от времени для различных концентраций блокатора фетуин, позволяет найти параметр эффективности ингибитора IC50 за счет 50% подавления сигнала интенсивности флуоресценции красителя DND-167.

В отличие от биологического метода (Фокусообразующих единиц (ФОЕ)), методика флуоресцентной детекции более точно определяет эффективность ингибитора за счет высокой чувствительности прибора. Также, что немаловажно при работе с живыми системами, данный метод позволяет проводить все необходимые манипуляции в течение 25 минут, в отличие от метода ФОЕ, требующего большего времени (порядка 24 часов).

Решение обратной задачи для нахождения кинетических параметров системы вирус-клетка.

Получение зависимости интенсивности флуоресценции от времени при проникновении вируса в клетку дает возможность определять константы скоростей связывания вирусных частиц с клеточными рецепторами (k+ и k_) и проникновения внутрь клетки (kin) данной системы решая обратную задачу с помощью подбора соответствующих параметров в уравнениях, описывающих адсорбцию вируса на клетке:

его проникновение внутрь клетки:

и суммарную концентрацию вируса, участвующего в процессе эндоцитоза:

В нашем случае мы детектируем сигнал, как с поверхности клетки, так и внутри нее. Однако, снаружи и внутри клетки заведомо разные pH, т.е. одно и то же количество частиц DND-167 (а значит и вирусных частиц) снаружи клетки и внутри будут давать разную интенсивность флуоресценции. Таким образом. детектируемый нами сигнал есть сумма интенсивностей внутри (Iin -описывается уравнением концентрации вирусных внутри клетки(3.5)) и на поверхности (Is -описывается уравнением концентрации адсорбировавшихся вирусных частиц(3.4)), с соответствующими коэффициентами

I=a·Is+b·Iin

Таким образом суммарная интенсивность флуоресценции от времени, детектируемая прибором:

Поскольку эти коэффициенты a и b взаимозависимы, то положим a=1.

Границы соотношений коэффициентов a и b определяются из данных, приведенных на рисунках 7 и 10.

Согласно этим данным, соотношение между интенсивностью при pH=6 и интенсивностью при pH=5,5 равно примерно 2,5, т.е.:

Таким образом, полученная зависимость I(t) (3.8) может быть записана в виде: