Метод флуоресцентной детекции

LysoSensor blue DND-167 Для наблюдения изменений, происходящих с клетками на первых стадиях проникновения вирусной частицы в клетку (Рисунок 4) применяли лизосенсор - рН-зависимый флюоресцентный маркер DND-167, интенсивность флюоресценции которого увеличивается при понижении рН в месте связывания вируса с клеточными рецепторами и внутри эндосомы от нормального значения до рН ~5 (Рисунок 5).

DND-167 имеет большую π-систему. В водной среде он может существовать как в виде положительно, так и отрицательных ионов. Концентрация каждой из его форм зависит от значения рН среды. При повышении рН он депротонируется превращаясь в отрицательный ион, при понижении соответственно, наоборот. Калибровочная зависимость интенсивности флюоресценции DND-167 от величины рН позволяет изучать кинетику лизосомальной активации клетки, индуцированной проникновением вируса в клетку.

Для проверки степени применимости красителя DND-167 к нашей задаче был снят спектр флуоресцении для различных pH среды.

Измерения проводились спектрофлуориметре RF-520 (Shimadzu, Япония) (Рисунок 6). Для исследования изменения спектра флуоресценции было приготовлено четыре пробирки с разными пробами. Каждая проба помещалась во флуориметр, где в течение всего эксперимента облучалась одной и той же длиной волны (360нм.). При помощи флуориметра измерялся спектр эмиссии пробы в диапазоне 380-500 нм. (рабочий диапазон красителя LysoSensor Blue DND-167 по паспортным данным) (Рисунок 7).

Образцы DND167 приготовлены в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), поддерживающем определённые значение рН. Для проведения эксперимента были выбраны следующие значения pH: 2, 4,3, 5,3, 6,4. pH измерялся при помощи pH метра PerpHecT METER (погрешность ± 0.05). Общая концентрация красителя во всех пробах была одинаковой.

Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна интенсивности поглощённого излучения и вероятности излучения кванта при переходе из возбужденного состояния в основное, то есть квантовому выходу флуоресценции:

Iфлуоресценции = Iпоглощённая·j ,

где j - квантовый выход флуоресценции.

Из представленных на рисунке 7 результатов видно, что спектры поглощения и флуоресценции зависят от значения рН. Отсюда можно сделать вывод о некоторых деталях механизма флуоресценции.

Зависимость интенсивности флуоресценции от рН:

Но квантовый выход флуоресценции j от рН не зависит, то есть:

Таким образом, показано, что уменьшение флуоресценции DND-167 при уменьшении рН вызвано не уменьшением квантового выхода, а уменьшением величины поглощения. Этот результат необходим для адекватной оценки полученных данных при работе с данным флуорофором на имеющемся оборудовании.

Также необходимо заметить, что длина волны пика флюоресценции (Рисунок 7) изменяется не более, чем на 4-5нм. и составляет , что является незначительным при сравнении с изменением интенсивности флуоресценции в пробах с различными pH.

TECAN Infinite 200 Разработанная в теоретической части работы кинетическая модель позволяет выделить два основных параметра, характеризующих взаимодействие вируса с клеткой - это константа диссоциации, константа проникновения и скорость изменения внутриэндосомальной рН. Экспериментальные исследования на монослое культуры клеток MDCK с использованием штамма вируса гриппа А/Aichi/2/68 и фетуина, молекулы-блокатора связывания вируса с клеткой, проводились на флуориметре TECAN серии Infinite 200 (Рисунок 8). Детектор в Infinite 200- ФЭУ, опционально чувствительный в УФ и красной областях; диапазон длин волн для измерения интенсивности флуоресценции: Ex 230 - 850 нм, Em 280 - 850 нм. (Рисунок 9); оптическая ширина щели Ex: < 9нм. для λ>295нм., Em: <20нм.; точность развертки спектра <±2нм. для λ>295нм.; диапазон измерения поглощения 0- 3OD с точностью < ± (1% + 0.010 OD). Температурный диапазон - 5ºС до 42ºС (поддерживается с точностью до 0.5 ºС).

При добавлении в лунку к окрашенному DND-167 клеточному монослою вирусной суспензии, происходит связывания вирионов с клеточными рецепторами за время порядка 5-10 минут, что приводит к пониженю pH в результате действия транс-мембранного потенциала и, как следствие, росту интенсивности флуоресценции лизо-сенсора. Из данных, полученных при изучении спектра флуоресценции красителя DND-167 (Рисунок 7), можно сделать вывод, что чувствительности прибора (0.5 fmol/лунка при измерении поверхностной флуоресценции) и точности измерения интенсивности флуоресценции TECAN Infinite 200 для каждой лунки планшета-96black, будет достаточно при изменении pH в диапазоне от 6 до 5 (что соответствует диапазону изменения pH на поверхности и в эндосоме клетки при проникновении вирусной частицы).