Частная технология антибиотиков

Температура в период первой фазы должны быть 30°С,. во вторую фазу 20 °С, рН в период роста гриба - ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы.

Синтез того или иного пенициллина зависит от наличия специфичного вещества в среде, иначе говоря, предшественника, который микроорганизм включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепления. Следует отметить, что предшественники биосинтеза пенициллина (фенилуксусная кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при определённых концентрациях и рН среды оказывают токсическое влияние на продуцента.

Фенилуксусная кислота наименее токсична. Добавление её в среду в концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост мицелия, особенно в первые 24 ч его развития.

Фенилуксусная кислота добавляется в концентрации от 100 до 500 мкг/мл через 24 ч развития Р. chrysogenum. При таких условиях обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 ч развития может достигать 500-1000 мкг/мл. [9]

При развитии гриба без внесения предшественника образуется около 45% бензилпенициллина и около 53% пенициллина К (радикал - n-гептилпенициллин).

При добавлении к среде фенилуксусной кислоты (C6H5CH2COOH) меняется соотношение образующихся компонентов в сторону резкого увеличения бензилпенициллина, количество которого в зависимости от возраста достигает 75-99% от смеси пенициллинов.

В процессе культивирования Р. chrysogenum в среде, не содержащей фенилуксусной кислоты, в ней накапливаются серосодержащие соединения не β - лактамного характера, близкие к цистеину и метионину. Добавление в среду фенилуксусной кислоты способствует более интенсивному метаболизму серосодержащих компонентов в соединения β - лактамного характера.

При развитии продуцента пенициллинов - гриба Р. chrysogenum - на кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы.

Первая фаза - рост мицелия, выход антибиотика низок. Всегда присутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медленно. Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в результате в среде появляется аммиак и резко поднимается значение рН.

Вторая фаза - максимальное образование пенициллина, это связано с быстрым потреблением лактозы и аммонийного азота. рH среды остаётся почти без изменений, увеличение массы мицелия незначительное, потребление кислорода снижается.

Третья фаза - снижение концентрации антибиотика в среде в связи с начавшимся автолизом мицелия и выделением в результате этого процесса аммиака, что сопровождается повышением рН среды.

Процесс биосинтеза пенициллина ведётся при самом тщательном соблюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур посторонней микрофлорой резко снижает накопление антибиотика. Это связало с тем, что многие бактерии воздуха способны образовывать пенициллиназу. Особенно активно продуцируют этот фермент B. subtilis и В. cereus.

Одним из активных продуцентов пенициллиназы является туберкулёзная палочка (Мусоb. tuberculosis). Предположительно именно с этим свойством связана резистентность этого микроорганизма к пенициллину.

Механизм биосинтеза молекулы пенициллина представлен на схеме:

Кетоглутарат + Ацетил-КоА

↓

Гомоцитрат

↓

α-кетоадипиновая кислота

↓α- аминоадипиновая кислота (L-α-ААК)

↓← L-цистеин

L-α-ААК- L -цистеин (LL-дипептид)

↓← L-валин

L-α-ААК-L-цистеин-D-валин (LLD-трипептид)

↓

Моноциклический β-лактам

↓

Изопенициллин N (L-α-ААК-6-АПК)

↓C6H5CH2COOH

Бензилпенициллин (C6H5CH2CO-6-АПК)

Современная промышленная микробиология получает культуральные жидкости, содержащие свыше 55 тыс. ед/мл. Выделение пенициллина начинается с фильтрации или центрифугирования (отделения мицелия гриба).