Оценка изменения динамического состояния мембраны нейтрофилов после инкубации в окислительных условиях

Для оценки изменения динамического состояния цитоплазматической мембраны был использован модифицированный нами спектрофотометрический метод определения адгезивных свойств клеток А. Бутакова. [49]

Для того, чтобы оценить вклад активации рецепторного комплекса нейтрофилов в подвижность и пластичность цитоплазматической мембраны, нами были проведены эксперименты спонтанной адгезии и адгезии, индуцированной присутствием в среде инкубации суточной культуры St. aureus .

Как видно из представленных результатов спонтанного теста адгезивная способность интактных клеток выше на 60 и 90 минуте инкубации. H2O2 обработанные нейтрофилы имеют максимум адгезии на 60 минуте и обладают адгезивной способностью в 1,5-2 раза превосходящей адгезивную способность интактных клеток.

Рисунок 22 - Изменение спонтанной адгезивной активности интактных и инкубированных в окислительных условиях нейтрофилов (p<0,05)

Изучение изменения индуцированной адгезивной способности нейтрофилов проводили с использованием опсонизированной компонентами объединенной донорской сыворотки культуры St. aureus. Полученные результаты представлены на рисунке 22.

Рисунок 22 - Изменение индуцированной адгезивной активности интактных и инкубированных в окислительных условиях нейтрофилов (p<0,05)

Как видно из представленных результатов теста адгезивная способность интактных клеток выше на 30 и 60 минуте инкубации. H2O2 обработанные нейтрофилы имеют максимум адгезии на 30 минуте и обладают адгезивной способностью в 1,5-2 раза достоверно превосходящей адгезивную способность интактных клеток.

Достоверность всех полученных результатов оценивалась с использованием анализа ANOVA по Фридмену и критерия Вилкоксона для зависимых групп с уровнем значимости 0,05. (приложение А 24-29)

Подобный результат отражает степень участия активированного рецепторного комплекса нейтрофилов в изменение динамической подвижности цитоплазматической мембраны и свидетельствует о значительном вкладе Fc рецепторов и рецепторов к компонентам системы комплемента при фагоцитозе.

Кроме того, повышенная адгезивная способность H2O2 обработанных нейтрофилов может также являться результатом активирующего действия окислительных условий на состояние всего рецепторного комплекса клеток, так как следует учесть тот факт, что при образовании рецептор-лигандного комплекса и активации рецептора в месте его локализации происходит образование локального липидного рафта, обеспечивающего быстрое проведение сигнала внутрь клетки. В области липидных рафтов подвижность липидного слоя мембраны увеличена, и образование множественных липидных рафтов может приводить к возрастанию динамической подвижности всей мембраны и к увеличению адгезивной способности в целом

Таким образом, в тестах индуцированной адгезии зарегистрирован эффект активации адгезивной способности H2O2 обработанных нейтрофилов по сравнению с интактными. Увеличение адгезивной способности нейтрофилов отражает структурно-функциональные изменениия цитоплазматической мембраны, индуцированные действием окислительных условий как на структурные компоненты и динамику цитоплазматической мембраны, так и на состояние мембранного рецепторного комплекса Возможно также позитивное изменение конформации молекул клеточной адгезии (L-селектин, интегрины, и др.) при изменении рН их микроокружения и/или увеличение их экспрессии на клеточной поверхности.

Заключение

Таким образом, по результатам проведенных экспериментов можно сделать следующие выводы:

1. Установлено активирующее действие инкубации в окислительных условиях (0,005 М, 0,01 М и 0,05 М Н2О2) на динамику основных параметров фагоцитарной реакции полиморфноядерных гранулоцитов. Показатели фагоцитарной активности Н2О2-обработанных нейтрофилов на 10-25% превышают значения контроля, а также наблюдается уменьшение времени, необходимого для достижения максимального количества клеток, вступающих в фагоцитоз. Поглотительная способность клеток, прединкубированных в окислительных условиях, возрастает на 20-40%.

2. Показано, что инкубированные в окислительных условиях нейтрофилы, демонстрируют в спонтанном и индуцированном НСТ тестах ферментативную активность в 2-2.5 раза превосходящую активность интактных клеток.

. Зарегистрировано увеличение активности миелопероксидазы нейтрофилов, инкубированных в окислительных условиях (0,01 М, 0,05 М) в 1,5-2 раза в спонтанном тесте и в 2-3 раза в индуцированном тесте по сравнению с контролем.