Изменение активности ферментов «дыхательного взрыва» нейтрофилов, подвергнутых инкубации в окислительных условиях

С целью изучения окислительно-восстановительной активности полиморфноядерных гранулоцитов, предварительно инкубированных с различными концентрациями перекиси водорода, использовали варианты модифицироанного нами спонтанного и индуцированного НСТ-теста в растворе с отбором проб каждые 30 мин инкубации и со спектрофотометрическим учетом результатов.

Спонтанный НСТ-тест отражает степень функциональной активации нейтрофилов in vivo в отсутствии чужеродных агентов. Поглощаемый нейтрофилами кислород восстанавливается до супероксидного радикала ферментами НАДФ-оксидазной системы, которая локализована на мембранах специфических гранул нейтрофилов. При контакте нейтрофила с чужеродным объектом и рецепторной активации клетки происходит слияние мембран специфических гранул с цитоплазматической мембраной и формируется полноценный НАДФ-оксидазный комплекс. При проведении спонтанного теста в отсутствии чужеродного объекта растворимый нитросиний тетразолий может проникать через цитоплазматическую мембрану и окисляться НАДФ-оксидазной системой специфических гранул до нерастворимого формазана, образующего гранулы в цитоплазме.

Полученные экспериментальные данные отражают различную динамику ферментативной активности НАДФ-оксидазного комплекса у интактных и Н2О2-обработаных клеток. Для интактных нейтрофилов характерно наличие подъема окислительной активности на 60 мин инкубации (рисунок 16).

Иную динамику изменения ферментативной активности окислительных ферментов имеют 0,005 М, 0,01 М, 0 05М Н2О2-обработанные нейтрофилы, максимум ферментативной активности наблюдается уже в первые 30 минут инкубации, повышенная активность сохраняется до 90 минуты, при этом активность их ферментов в 1,8-2,5 раза достоверно превосходит значения контроля.

Кроме этого следует отметить наличие только одного максимума ферментативной активности на 60 минуте с последующим плавным снижением этого параметра к 90 минуте инкубации.

Рисунок 16 - Изменение активности окислительных ферментов интактных и инкубированных в окислительных условиях нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте (p<0,05)

Достоверность всех полученных результатов оценивалась с использованием анализа ANOVA по Фридмену и критерия Вилкоксона для зависимых групп с уровнем значимости 0,05. (приложение А7-9)

При анализе полученных данных становится очевидно, что Н2О2-обработанные нейтрофилы, демонстрирующие в спонтанном тесте Надф-оксидазную активность в 1,8-2,5 раза превосходящую активность интактных клеток, находятся в активированном состоянии, которое было индуцировано предварительной инкубацией с перекисью водорода. Можно предположить, что действие перекиси водорода на рецепторный комплекс цитоплазматической мембраны и непосредственно на мембрану вызывает образование множественных липидных рафтов и неспецифическую активацию рецепторов, что, в свою очередь, приводит в движение специфические гранулы, в мембранах которых находятся компонентны НАДФ-оксидазного комплекса. Слияние специфических гранул с цитоплазматической мембраной приводит к образованию полноценной НАДФ-оксидазы, способной осуществлять каталитические реакции окисления НСТ с большой скоростью.

Для оценки динамики активности НАДФ-оксидазного комплекса интактных и Н2О2-обработанных нейтрофилов в процессе фагоцитарной реакции был поставлен НСТ тест в присутствии опсонизированной компонентами объединенной донорской сыворотки культуры St. aureus, результаты которого представлены на рисунке 17.

Рисунок 17 - Изменение активности окислительных ферментов интактных и инкубированных в окислительных условиях нейтрофилов в процессе фагоцитарной реакции (индуцированный НСТ-тест в присутствии культуры St.aureus) (p<0,05)

Очевидно, что индуцированная НАДФ-оксидазная активность интактных нейтрофилов в процессе фагоцитарной реакции имеет динамику, аналогичную динамике ферментативной активности в спонтанном тесте - подъемы активности на 60 минуте инкубации.

Максимальная активность НАДФ-оксидазы в процессе фагоцитоза у 0,005, 0,01 и 0,05 М Н2О2-обработанных нейтрофилов наблюдается на начальной стадии реакции в течение первых 30 минут с последующим увеличении е к 90 минуте инкубации. Следует отметить, что во всех экспериментальных пробах активность НПДФ-оксидазы в 2-2,5 раза достоверно превышает активность контрольных проб.

Достоверность всех полученных результатов оценивалась с использованием анализа ANOVA по Фридмену и критерия Вилкоксона для зависимых групп с уровнем значимости 0,05. (приложение А 10-13)

Сборка НАДФН-оксидазной системы сопряжена с функционированием актинового цитоскелета. При воздействии белков бактерий, поверхностно активных веществ (форболовые эфиры, дигитонин) при индуцированном НСТ-тесте наблюдается резкое увеличение интенсивности и скорости мобилизации энергетических и пластических ресурсов клеток, т. е. происходит дыхательный взрыв. Именно этим можно объяснить увеличение ферментативной активности при индуцированном НСТ-тесте.