Материалы и методы исследования

Использованные материалы

В работе были использованы следующие реактивы: хлорид натрия NaCl («Пять океанов», г. Минск, хч), хлорид калия KCl («Пять океанов», г.Минск, хч), гидрофосфат натрия NaH2PO4 («Пять океанов», г.Минск, хч), глюкоза, перекись водорода Н2О2 («Пять океанов», г.Минск, хч), фиколл-верографин («Sigma», Германия, хч), краситель Романовского-Гимзы («МиниМед», г.Брянск), нитросиний тетразолий, уксусная кислота («Лаверна», г. Москва, хч), диметилсульфоксид («НеваРеактив», г. Санкт-Питербург, хч), среда Хенкса с феноловым красным. В качестве основного буферного раствора использовали 10мМ калий-натрий фосфатный буфер, содержащий 140мМ NaCl, 10мМ KCl, 10мМ NaH2PO4, 5мМ глюкозы, рН 7,3.

Непосредственно перед экспериментами готовили необходимые растворы Н2О2 в концентрациях: 0,005М; 0,01М; 0,05М. В экспериментах использовалась суспензии клеток Staphylococcus aureus, предварительно опсонированных компонентами объединенной донорской сыворотки.

Получение полиморфноядерных гранулоцитов из периферической крови

В экспериментах была использована кровь двадцати здоровых доноров.

Для получения нейтрофилов к цельной венозной крови добавляли равный объем рабочего буфера, а затем наслаивали на градиент фиколл-верографина (ρ=1,085/1,18 ) в соотношении объемов 2:1, центрифугировали 30 минут при 2000 об/мин, после чего отбирали образовавшийся слой лейкоцитов. К выделенной клеточной суспензии добавляли 10мМ К,Na-фосфатный буфер. Концентрацию лейкоцитов определяли путем подсчета в камере Горяева. Количество жизнеспособных клеток с использованием витального красителя.

Инкубация полиморфноядерных гранулоцитов с Н2О2

Непосредственно перед экспериментом готовили разведения Н2О2 таким образом, чтобы конечные концентрации в экспериментальных пробах составляли: 0,005М, 0,01М, 0,05М. Выделенные нейтрофилы подвергались инкубации с соответствующими концентрациями Н2О2 в конечном объеме 200 мкл в течение 20 минут при 37˚С. Клетки осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 2000 об/мин, надосадочную жидкость удаляли. Затем клетки промывали дважды 10мМ К,Na-фосфатным буфером для удаления перекиси из среды инкубации.

Определение фагоцитарной активности полиморфноядерных гранулоцитов

Суспензию интактных или обработанных различными концентрациями Н2О2 нейтрофилов смешивали в равных соотношениях с суспензией предварительно опсонизированной пуловой донорской сывороткой культурой St. aureus и инкубировали при 37˚С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии из которых готовили мазки с последующим окрашиванием по методу Романовского-Гимзы. Определение фагоцитарного показателя и фагоцитарного числа проводили с использованием стандартной методики при условии подсчета не менее 100 лейкоцитарных клеток.

мембрана нейтрофил кровь окислительный

Исследование активности окислительных ферментов полиморфноядерных гранулоцитов в тесте восстановления нитросинего тетразолия

Для определения активности окислительных ферментов использовали тест спонтанного и индуцированного восстановления нитросинего тетразолия.

При проведении спонтанного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл, затем добавляли свежеприготовленный раствор НСТ реактива (0,8 %) в таком же объеме и 200 мкл рабочего буфера и инкубировали при температуре + 37˚С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл ДМСО. Пробы инкубировали при + 37˚С в течение 60 минут, затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 640 нм.

При проведении индуцированного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл, затем добавляли свежеприготовленный раствор НСТ реактива (0,8 %) в таком же объеме и 200 мкл суточной культуры St. aureus и инкубировали при температуре + 37˚С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл ДМСО. Пробы инкубировали при + 37˚С в течение 60 минут, затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 640 нм. в объеме 200 мкл.

Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов

Для определения активности миелопероксидазы нейтрофилов использовали тест спонтанного и индуцированного окисления ортофенилендиамина.

При проведении спонтанного теста инкубированные с различными концентрациями Н2О2 и интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл и 200 мкл рабочего буфера и инкубировали при температуре + 37˚С. Через 30, 60, 90, 120 и 150 минут из реакционной смести отбирали аликвоты клеточной суспензии (100 мкл) и вносили в пробирки с 500 мкл субстратной смеси состоящей из ортофенилендиамина (0,04%) и 0,002% перекиси водорода на фосфатно-цитратном буфере, pH=5,0. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10 % серной кислоты, затем центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.