Данные, полученные методом ФОЕ

Данные параметры позволят более адекватно подобрать аппроксимацию для решения обратной задачи флуоресцентной детекции, а также позволят оценить степень достоверности результатов полученных методом флуоресцентной детекции.

· Данные, полученные методом флуоресцентной детекции

Для более быстрой оценки IC50 и для более тщательного исследования вирус-клеточного взаимодействия мы предлагаем новый метод - флуоресцентной детекции. Суть его заключается в детекции изменений, происходящих на поверхности и внутри клетки во время процесса эндоцитоза (подробнее - Материалы и Методы).

Для этого мы использовали лизо-сенсор DND-167, интенсивность флуоресценции которого резко увеличивается при понижении pH в диапазоне от 6, до 5. Этот же диапазон соответствует изменению pH на поверхности и в эндосоме клетки при проникновении вируса. Таким образом, наблюдая изменение интенсивности флуоресценции окрашенного вируса на поверхности и внутри клетки, мы можем судить о стадии процесса эндоцитоза в текущий момент времени.

На рисунке 16 изображена зависимость интенсивности флуоресценции от времени, прямопропорциональная концентрации вируса, участвующего в процессе эндоцитоза (3.6). На первых 10 минутах взаимодействия вируса с клеточными рецепторами виден пик флуоресценции, что говорит о начале адсорбции вируса на поверхность клеток (в данном случае DND-167 активируется за счет понижения pH в местах связывания вируса с клеткой, происходящего в результате конформационных изменений HA). Далее, интенсивность не спадает до нуля, а выходит на некоторый уровень, что свидетельствует о постепенном проникновении вируса в клетку (здесь начинается активация лизо-сенсора DND-167 за счет снижения pH в эндосоме клетки). Данную интерпритацию подтверждает та же зависимость, но для ингибированного фетуином (концентрация ~3·10-8М) вируса: пик флуоресценции сдвигается в район 16 минут, что говорит о торможении процесса адсорбции за счет введения конкурента; общая интенсивность падает ~ в 5 раз, что говорит о торможении всего процесса эндоцитоза и постепенной остановке проникновения вируса в клетку.

) Нахождение параметра эффективности ингибитора IC50

Исследуя зависимость интенсивности сигнала флуоресценции после 20 минут взаимодействия вируса с клеточной суспензией от концентрации блокатора фетуина, стало очевидно, что чем больше концентрация ингибитора, тем сильнее подавляется сигнал флуоресценции. Таким образом был проведен расчет IC50 методом пробит-анализа на основе полученных экспериментальных зависимостей «Доза ингибитора - ингибирующий эффект» используя результаты зависимости подавления сигнала флуоресценции от концентрации блокатора фетуина.

На рисунке 17 представлена зависимость доли подавления заражения культуры клеток MDCK вирусом гриппа штамма A/Aichi/2/68 от логарифма дозы ингибитора фетуин.

Рассчитанный IC50 составляет М.

) Применение построенной теоретической модели на кинетическом эксперименте