Рецепторное взаимодействие вируса и клетки

Подавление распространения вирусной инфекции вероятнее всего на этапе связывания вируса с клеточными рецепторами [34] по принципу ингибирования НА-опосредованной адгезии вируса гриппа с помощью синтетических аналогов [19], эффективность которых характеризуется параметром IC50. IC50 - доза ингибитора, необходимая для 50% подавления заражения, которую можно проанализировать в культуре клеток. Нахождение данного параметра напрямую связано с получением не только данных об эффективности противовирусного препарата, но и нахождением параметров кинетических уравнений, описывающих процесс эндоцитоза.

В работе [35] проанализировано стационарное состояние адсорбированного вируса, неспособного к проникновению, в зависимости от различных типов связывания - моновалентного, мультивалентного и мультивалентного с насыщением поверхности клетки вирусом. К сожалению, полученные аналитические выражения слишком громоздки для практического применения и включают в себя большое число неизвестных параметров, что также затрудняет их использование.

Следует отметить, что многие экспериментальные данные получены именно в предположении простейшей модели связывания, когда молекулы лиганда и рецептора рассматриваются как свободные и моновалентные. В действительности взаимодействие является мультивалентным. К тому же, в реальной биологической системе взаимодействие вирус-клетка, как правило, происходит в условиях, когда один из реагентов является иммобилизованным на поверхность либо культуральной посуды, либо в тканях организма, что является случаем гетерогенного связывания.

При моделировании мультивалентного связывания наибольшее распространение получило «приближение эквивалентных мест связывания» («equivalent site approximation»), в котором места для связывания лиганда полагаются идентичными и взаимодействующими с различными рецепторами независимо [36]. При этом пренебрегается возможными внутримолекулярными реакциями, которые, например, могут иметь место для мультивалентных рецепторов [37].

При таком подходе мультивалентный лиганда с валентностью n может связаться с поверхностью клетки i=1,…,n раз. Анализ в случае наличия кооперативного связывания (в случае сильно выраженной положительной кооперативности) может быть сильно упрощен [38], если предположить, что кооперативное лиганд-рецепторное взаимодействие описывается схемой

Даже в равновесии и в случае очень сильных упрощающих предположений, уравнения на концентрации реагентов достаточны сложны.

Значения константы скорости ассоциации комплекса антиген-антитело опубликованные в научной литературе, колеблются от 106 до 108 М-1с-1. В то время как значения для константы скорости диссоциации комплекса антиген-антитело варьируются в больших пределах от 10-4 до 10000 с-1 [39]. Такая разница в разбросе значений для констант скоростей прямой и обратной реакций ведет к предположению, которое на сегодняшний день является общепризнанным взглядом: константы скорости прямой реакции связывания отличаются для разных молекул антигена и антитела несильно, а имеющиеся различия в константах связывания обусловлены в основном различиями в константе скорости диссоциации. Выражение для равновесной константы диссоциации легко получить из уравнения (учитывая (1.1)):

Особенностью методического подхода, реализованного в данной работе, является определение кинетических параметров вирус - клеточной системы с помощью детекции изменения pH при образовании вирус-рецепторного комплекса (необратимой адсорбции) и при проникновении вирусной частицы в эндосому клетки.

· Цель работы

Целью данной работы является изучение кинетики активации клетки в результате рецептор-обусловленного эндоцитоза вирусной частицы. В ходе выполнения работы решались следующие задачи:

o Разработка нового метода исследования вирус-клеточного взаимодействия с применением флуоресцентной детекции

o Построение теоретической модели и разработка методики нахождения кинетических параметров вирус-клеточного взаимодействия и определения эффективности ингибитора с применением флуоресцентной детекции Применение построенной теоретической модели для аппроксимации результатов кинетического эксперимента Сравнение стандартных вирусологических (ФОЕ и ИФА) и нового флуоресцентного методов оценки эффективности ингибитора